Pengurutan DNA: Perbedaan antara revisi
Konten dihapus Konten ditambahkan
tambah |
tata ulang subjudul, tambah |
||
Baris 1:
{{underconstruction}}
'''Sekuensing DNA''' adalah proses atau teknik penentuan urutan [[basa nukleotida|basa]] [[nukleotida]] pada suatu molekul [[DNA]]. Urutan tersebut dikenal sebagai [[sekuens DNA]].
|author=Glick, B.R., Pasternak, J.J., Patten, C.L.
|title=Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA▼
|year=2010▼
|edition=4▼
|location=Washington, DC
|publisher= ASM Press
|pages=117–118▼
}} ({{google books with page|Wz3CtTBe9aUC|lihat|118|function}})▼
</ref> Teknik ini digunakan dalam riset dasar [[biologi]] maupun berbagai bidang terapan seperti [[kedokteran]],<ref>{{en}} {{cite book
|author=Sweet, K.M., Michaelis, R.C.
|title=The Busy Physician's Guide to Genetics, Genomics and Personalized Medicine
Baris 18 ⟶ 27:
|pages=30
}} ({{google books with page|8FXS_0tg2p8C|lihat|30|sequencing}})
</ref> dan [[antropologi]].<ref>{{en}} {{citation
|author=
|title=Mitochondria
▲|title=Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA
|edition=2
▲|year=2010
|year=2008
▲|edition=4
|location=
|publisher=John
|chapter=Mitochondrial DNA Sequencing and Anthropology
▲|pages=117–118
}} ([http://books.google.co.id/books?id=AWRaAfdarD8C&pg=PT410&dq=%22DNA+sequencing%22+anthropology&hl=id&sa=X&ei=BjtaT8TqOoTF0QXK2rXbDQ&ved=0CD8Q6AEwAQ#v=onepage&q=%22DNA%20sequencing%22%20anthropology&f=false lihat] di Penelusuran Buku Google)
▲}} ({{google books with page|Wz3CtTBe9aUC|lihat|118|function}})
</ref>
</ref> Teknik sekuensing DNA mulai dikembangkan pada tahun 1970-an dan telah menjadi hal rutin dalam penelitian [[biologi molekular]] pada dekade berikutnya berkat dua teknik yang dikembangkan secara independen namun hampir bersamaan oleh tim [[Walter Gilbert]] di [[Amerika Serikat]] dan tim [[Frederick Sanger]] di [[Inggris]] sehingga kedua ilmuwan tersebut mendapatkan [[Penghargaan Nobel Kimia]] pada tahun [[1980]].<ref>{{en}} {{cite book▼
▲
|author=Sambrook, J., Russel, D.W.
|title=Molecular Cloning: A Laboratory Manual
Baris 36 ⟶ 47:
|publisher=Cold Spring Harbor Laboratory Press
|pages=12.3
}} ([http://books.google.fr/books?id=YTxKwWUiBeUC&pg=SA12-PA3&dq=1970s+routine lihat] di Penelusuran Buku Google)</ref><ref>Glick ''et al.'' (2010) [http://books.google.com/books?id=Wz3CtTBe9aUC&pg=PA110&dq=Nobel hlm. 110]</ref> Selanjutnya, metode Sanger menjadi lebih umum digunakan dan berhasil diautomatisasi pada pertengahan 1980-an. Sejak tahun 1995, berbagai proyek [[genom]] yang bertujuan menentukan sekuens keseluruhan DNA pada banyak [[organisme]] telah diselesaikan,
== Aplikasi ==
Baris 73 ⟶ 84:
== Metode ==
=== Metode Maxam-Gilbert ===▼
Dewasa ini, hampir semua usaha sekuensing DNA dilakukan dengan menggunakan ''metode terminasi rantai'' yang dikembangkan oleh [[Frederick Sanger]] dan rekan-rekannya [http://www.pubmedcentral.gov/articlerender.fcgi?artid=431765]. Teknik tersebut melibatkan terminasi atau penghentian reaksi sintesis DNA ''in vitro'' yang spesifik untuk sekuens tertentu menggunakan substrat nukleotida yang telah dimodifikasi. ▼
Pada waktu yang kira-kira hampir bersamaan dengan dikenalkannya metode sekuensing Sanger, Maxam dan Gilbert mengembangkan metode sekuensing DNA yang didasarkan pada modifikasi kimiawi DNA yang dilanjutkan dengan pemotongan DNA [http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pubmed&pubmedid=265521].▼
Metode ini mulanya cukup populer karena dapat langsung menggunakan DNA hasil pemurnian, sedangkan metode Sanger pada waktu itu memerlukan [[kloning]] untuk membentuk DNA untai tunggal. Seiring dengan dikembangkannya metode terminasi rantai, metode sekuensing Maxam-Gilbert menjadi tidak populer karena kerumitan teknisnya, digunakannya bahan kimia berbahaya, dan kesulitan dalam ''scale-up''.▼
=== Metode Sanger ===
[[Berkas:Sequencing.jpg|thumb|right|Gel sekuensing metode Sanger yang telah dilabel radioaktif.]]
[[Berkas:Sequencing.jpg|thumb|right|Gel sekuensing metode Sanger yang telah dilabel radioaktif.]]Pada metode terminasi rantai (metode Sanger), perpanjangan atau ekstensi rantai DNA dimulai pada situs spesifik pada DNA cetakan dengan menggunakan oligonukleotida pendek yang disebut ''primer'' yang komplementer terhadap DNA pada daerah situs tersebut. ''Primer'' tersebut diperpanjang menggunakan [[DNA polimerase]], enzim yang me[[replikasi]] DNA. Bersama dengan ''primer'' dan DNA polimerase, diikutsertakan pula empat jenis basa [[deoksinukleotida]] (satuan pembentuk DNA), juga nukleotida pemutus atau penghenti rantai (''terminator'' rantai) dalam konsentrasi rendah (biasanya '''di-'''deoksinukleotida). Penggabungan nukleotida pemutus rantai tersebut secara terbatas kepada rantai DNA oleh polimerase DNA menghasilkan fragmen-fragmen DNA yang berhenti bertumbuh hanya pada posisi pada DNA tempat nukleotida tertentu tersebut tergabungkan. Fragmen-fragmen DNA tersebut lalu dipisahkan menurut ukurannya dengan [[elektroforesis gel poliakrilamida]], atau sekarang semakin lazim dengan elektroforesis menggunakan tabung gelas berjari-jari kecil (pipa kapiler) yang diisi dengan polimer kental.▼
▲Dewasa ini, hampir semua usaha sekuensing DNA dilakukan dengan menggunakan ''metode terminasi rantai'' yang dikembangkan oleh [[Frederick Sanger]] dan rekan-rekannya [http://www.pubmedcentral.gov/articlerender.fcgi?artid=431765]. Teknik tersebut melibatkan terminasi atau penghentian reaksi sintesis DNA ''in vitro'' yang spesifik untuk sekuens tertentu menggunakan substrat nukleotida yang telah dimodifikasi.
▲
Seiring dengan perkembangannya, kini terdapat beberapa macam metode sekuensing terminasi rantai yang berbeda satu sama lain terutama dalam hal pendeteksian fragmen DNA hasil reaksi sekuensing.
Baris 93 ⟶ 109:
Untuk memperoleh hasil reaksi berlabel yang dapat dideteksi dari DNA cetakan, metode "sekuensing daur" (''cycle sequencing'') paling lazim dilakukan. Dalam metode ini dilakukan berturut-turut penempelan ''primer'' (''primer annealing''), ekstensi oleh polimerase DNA, dan denaturasi (peleburan atau ''melting'') untai-untai DNA cetakan secara berulang-ulang (25–40 putaran). Kelebihan utama sekuensing daur adalah lebih efisiennya penggunaan pereaksi sekuensing yang mahal ([[BigDye]]) dan mampunya mengurutkan templat dengan struktur sekunder tertentu seperti ''hairpin loop'' atau daerah kaya-GC. Setiap tahap pada sekuensing daur ditempuh dengan mengubah temperatur reaksi menggunakan mesin pendaur panas (''thermal cycler'') [[PCR]]. Cara tersebut didasarkan pada fakta bahwa dua untai DNA yang komplementer akan saling menempel (berhibridisasi) pada temperatur rendah dan berpisah (terdenaturasi) pada temperatur tinggi. Hal penting lain yang memungkinkan cara tersebut adalah penggunaan enzim DNA polimerase dari organisme termofilik (organisme yang hidup di lingkungan bertemperatur tinggi), yang tidak mudah terurai pada temperatur tinggi yang digunakan pada cara tersebut (>95 °C).
===Sekuensing generasi berikutnya===
▲=== Metode Maxam-Gilbert ===
==== Pyrosequencing ====▼
▲Pada waktu yang kira-kira hampir bersamaan dengan dikenalkannya metode sekuensing Sanger, Maxam dan Gilbert mengembangkan metode sekuensing DNA yang didasarkan pada modifikasi kimiawi DNA yang dilanjutkan dengan pemotongan DNA [http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pubmed&pubmedid=265521].
▲Metode ini mulanya cukup populer karena dapat langsung menggunakan DNA hasil pemurnian, sedangkan metode Sanger pada waktu itu memerlukan [[kloning]] untuk membentuk DNA untai tunggal. Seiring dengan dikembangkannya metode terminasi rantai, metode sekuensing Maxam-Gilbert menjadi tidak populer karena kerumitan teknisnya, digunakannya bahan kimia berbahaya, dan kesulitan dalam ''scale-up''.
▲=== Pyrosequencing ===
Pyrosequencing adalah teknik pemetaan [[DNA]] yang berdasarkan deteksi terhadap [[pirofosfat]] (PPi) yang dilepaskan selama [[sintesis]] DNA.<ref name=poirel/> Teknik ini memanfaatkan [[reaksi]] [[enzimatik]] yang dikatalisis oleh [[ATP sulfurilase]] dan [[luciferase]] untuk pirofosfat inorganik yang dilepaskan selama penambahan [[nukleotida]].<ref name=poirel>{{en}} Poirel L, Naas T, Nordmann P. 2006. Pyrosequencing as a Rapid Tool for Identification of GES-Type Extended-Spectrum Lactamases. ''J Clin Microbiol'' 44(8):3008-11.</ref>
| |||