Meskipun enzim biasanya sangat spesifik, beberapa mampu melakukan katalisis pada lebih dari satu substrat, suatu sifat yang dinamakan [[promiskuitas enzim]]. Suatu enzim dapat memiliki banyak substrat alami dan [[enzim#spesifisitas|spesifisitas]] yang lebar (misalnya, oksidasi oleh [[sitokrom p450]]) atau dapat memiliki substrat tunggal dengan seperangkat substrat non-aktifnonaktif yang dapat dikatalisis dengan laju yang lebih rendah. Substrat yang diberi enzim tertentu sehingga dapat bereaksi dengan ''[[in vitro]]'', dalam keadaan laboratorium, mungkin tidak mencerminkan substrat fisiologis dan endogen dari reaksi enzim secara ''[[in vivo]]. Artinya, enzim tidak harus melakukan semua reaksi dalam tubuh yang mungkin terjadi di laboratorium. Sebagai contoh, sementara [[asam lemak amida hidrolase]] (FAAH) dapat menghidrolisis endokanabinoid [[2-arakidonoilgliserol]] (2-AG) dan [[anandamida]] pada tingkat setara '' in vitro '', gangguan genetik atau farmakologis FAAH mengangkat anandamida tapi tidak 2-AG, menunjukkan bahwa 2-AG bukanlah substrat endogen, in vivo untuk FAAH.<ref name="Cravatt2001">{{cite journal | date=2001 | first1=B.F. | first2=K. | first3=M.P. | first4=M.H. | first5=D.K. | first6=B.R. | first7=A.H. | journal=[[Proc. Natl. Acad. Sci. USA]] | issue=16 | doi=10.1073/pnas.161191698 | last1=Cravatt | title=Supersensitivity to anandamide and enhanced endogenous cannabinoid signaling in mice lacking fatty acid amide hydrolase | last2=Demarest | last3=Patricelli | last4=Bracey | last5=Gaing | last6=Martin | last7=Lichtman | volume=98 | pages=9371–9376 | pmid=11470906 | pmc=55427}}</ref> Contoh lain, ''N''-asil taurin (NAT) teramati meningkat drastis dalam hewan yang FAAH nya terganggu, tetapi secara aktual miskin substrat FAAH ''in vitro''.<ref name="Saghatelian2004">{{cite journal | first1=A. | last1=Saghatelian | title=Assignment of Endogenous Substrates to Enzymes by Global Metabolite Profiling | date=2004 | last2=Trauger | first2=S.A. | last3=Want | first3=E.J. | last4=Hawkins | first4=E.G. | last5=Siuzdak | first5=G. | last6=Cravatt | first6=B.F. | journal=Biochemistry | volume=43 | issue=45 | pages=14322–14339 | doi=10.1021/bi0480335 | pmid=15533037}}</ref>
